X

在线客服

在线咨询

在线咨询

咨询热线021-5954 1913

请扫描二维码

进入微信公众号

公司新闻

多能干细胞(ES/iPS)冻存和复苏方法

2019/4/29 15:28:58浏览次数:162

      多能干细胞(ES/iPS)冻存是干细胞扩增传代过程中重要的一环,但是多能干细胞不同于普通细胞系,其增殖扩增过程中需要聚团生长,为保持其细胞活性,不建议单细胞传代。而且使用血清+DMSO冻存方法,不能很好的保持细胞活性,且复苏细胞成活率较低。本文就重点介绍多能干细胞进行冻存以及解冻的标准化步骤。
      介绍使用AppliedCell™ 多能干细胞培养基以及Advance多能干细胞培养基培养的细胞,

  本方法适用于AppliedCell™ 多能干细胞培养基以及Advance多能干细胞培养基培养的细胞(同样适用于mTesR以及E8系统培养的细胞),冻存以及复苏前后,应当使用同一种培养基,复苏传代后可以更换其他培养体系。
       Serum-Free干细胞冻存液(AC-1001011/12)是埃泽思生物专为ES/iPS  细胞设计的的一款化学成分确定,无血清,无动物源成分,且无需程序降温的高效冻存液。具体冻存及复苏操作方法如下:

         1、冻存:以下操作方法以6孔板为例:

(1) Serum-Free干细胞冻存液为即拿即用,且4℃保存,冻存液拿出后应快速放回4℃;

(2)使用多能干细胞消化液(AC-1001008)消化细胞;

(3)收集细胞,室温300×g离心5分钟;

(4)小心吸掉上清液,不要干扰细胞团;

(5)用1ml冻存液重悬细胞,并均匀分装到冻存管中
  采用非程序降温法,将冻存管直接放入-80℃冰箱中,冻存24h后转移至液氮中长期保存。  
  2、解冻

  预先包被细胞培养板,人ES和iPS细胞解冻后应立即接种到培养板中。

(1)多能干细胞培养基/Advance 多能干细胞培养基室温平衡15-30min,不能37℃加热;   

(2)在水浴锅中持续晃动冻存管,37℃水浴锅中快速解冻细胞,直至细胞完全融化; 

(3)取出冻存管,用70%乙醇擦拭冻存管表面;

(4)准备15mL离心管,预先加入5mL多能干细胞培养基,将细胞悬浮液缓慢逐滴至15mL离心管中,尽量保持细胞聚团状态。

(5)在室温300×g离心5分钟。

(6)吸掉上清,注意不要干扰细胞沉淀。使用1mL多能干细胞培养基轻轻地重悬细胞3-5次,不要破坏细胞聚团状态。
(7)分别取0.5mL细胞悬液,均匀接种到包被好的6孔板的2个孔中,并分别补充多能干细胞培养基至2m。
(8)置于37°C细胞培养箱中。在前后左右呈十字形摇动培养板板5次,以均匀分散细胞。
(9)每天更换培养基,并显微镜下观察细胞状。